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科技服务-新一代测序技术服务指南-转录组分析（RNA-Seq）服务介绍
服务内容：
测序和基本数据处理对客户提供的mRNA（或总 RNA）进行样品检测，样品检测合格后采取以下技术路线对进行solexa测序：转录组样品制备――cluster制备――solexa上机
基本信息分析包括：图像识别，Basecalling，过滤接头序列，检测可能的样品污染
高级信息分析
单通道（Lane）数据高级分析价格表
| 服务项目 | 价格 |
|---|---|
| Reads 数目统计及频率分布图，库容饱和度分析 | 根据客户选择的服务项目，在测序单价基础上加收30%的信息分析费 |
| 将reads比对到参考基因、基因组 | |
| Reads在参考基因中的位置分布情况 | |
| 参考基因组及参考基因覆盖深度分布、覆盖程度分布 | |
| 参考基因的GC含量与覆盖深度或覆盖程度间的关系 | |
| 参考基因的长度与覆盖深度或覆盖程度间的关系 | |
| Reads在基因组分布状况 | |
| 将reads组装成Contig | |
| Contig长度分布统计 | |
| Contig覆盖深度统计 | |
| Contig长度与覆盖深度的关系 | |
| 将Contig比对到参考基因、基因组 | |
| 对Congtig 进行注释 |
除以上分析外，我们可以根据客户需要进行转录边界区域鉴定、可变剪切发现与鉴定等“个性化”分析服务。
技术路线：
高通量的测序技术，帮助研究人员获得研究对象基因组转录区域信息，辅助研究人员在全基因组范围内，鉴定转录发生位点，转录边界，可变剪切等。其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。
RNA-Seq实验流程
应用领域：
- 转录本结构研究：UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究、Start codon鉴定等。
- 非编码区域功能研究：non-coding RNA研究、microRNA前体研究等。
- 基因转录水平研究
- 全新转录区域研究
技术特点：
| 检测能力 | RNA-Seq |
|---|---|
| 检测信号 | 数字信号 |
| 数据通量 | Single End:>123M/lane; > 1.3G/run Paired End:300M/lane; >2G /run |
| 检测范围 | 所有转录本 |
| 检测精度 | 从几个到10万个拷贝精确计数 |
| 分辨率 | 可以检测单个碱基差异（Allel Specific Expression），基因家族中相似基因以及可变剪切造成的不同转录本的表达 |
研究案例：
酵母转录组研究[1]
Yale的研究人员提取酵母BY4741(leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 his3Δ1)的总RNA后，通过OligodTprimed和hexamer primed两种方法分别构建solexa测序文库，并进行solexa single end测序。每种技术分别进行两次技术重复和两次生物学重复实验。
| DT | DT-tech-rep | DT-bio-rep | RH | RH-tech-rep | RH-bio-rep | Total | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Total Tags | 3,854,691 | 6,825,837 | 3,444,654 | 3,681,701 | 5,885,683 | 6,219,951 | 29,912,517 |
| Total mapped Tags | 2,265,935 | 3,547,010 | 1,710,922 | 2,121,670 | 3,277,235 | 3,110,515 | 16,133,287 |
| Total mapped unique tags | 2,236,681 | 3,594,972 | 1,694,274 | 2,084,476 | 3,223,238 | 3,036,899 | 15,870,540 |
酵母RNA-Seq数据结果统计
- 良好的重复性：两种不同的技术路线，无论在技术重复，生物学重复还是相互之间都具有良好的相关系数。
Oligo(dT)和random hexamer的技术重复和生物学重复的数据比较
- 高通量测序帮助发现全新转录区域：高通量测序帮助Yale的研究人员从酵母基因间区域内发现全新的转录区域。在检测出的487个基因间区域中，204个是在以往的芯片和cDNA研究没有发现过的。在对其中18个区域进行Real-Time PCR实验后，有16个区域得到证实。
- 精确鉴定转录边界（Transcriptional boundary）：RNA-Seq结果与5′RACE结果比较，77.9%的5’UTR边界在两种方法结果中±50bp。 即使多个转录本在3’端相互重叠的情况，RNA-Seq也能精确鉴定出3’边界。
对注释较少的ChrVI区域的UTR进行新的注释
ORFs以虚线表示，箭头表示转录方向；UTR以绿色框表示，高可信度的cDNA以红色和低可信度的cDNA以蓝色表示。
- 研究可变剪切（Alternaltive splicing）：RNA-Seq为研究基因的可变剪切提供了更简易的研究手段。研究人员在含有GT和AG/AC的306个introns中发现，其中240个intron能在测序结果中找到包含其边界的tag，从而证明来自这些基因的转录本存在可变剪切。
定量分析基因表达水平：RNASeq可以定量分析基于的表达水平。Yale的研究人员对RNA-Seq结果中34个可能的高表达，中度表达以及低表达的基因进行qPCR验证，发现相关系数R＝0.98。